Serratia marcescens est une bactérie opportuniste
qui produit naturellement un pigment rouge sang à activité antibiotique
et immunosuppressive : la prodigiosine. La prodigiosine est produite en tant
que métabolite secondaire.
La synthèse de la prodigiosine s'effectue en plusieurs
étapes, codées par des gènes qui peuvent chacun être
affectés par les UV (mutation) et produire une pigmentation incomplète
(pigment orange ou rosé) ou même l'absence de pigmentation.
Il faut noter qu'un même phénotype peut provenir de mutations à
des niveaux différents dans la voie de synthèse (génotypes
différents) :
Localisation de points de mutation dans la voie de biosynthèse de la
prodigiosine. La prodigiosine est le pigment habituel rouge et la norprodigiosine
est le pigment orange produit par les mutants de classe B3. MAP = 2-méthyl-3-n-amyl
pyrole ; MBC = 4-methoxy-2,2'-bipyrole-5-carboxyaldéhyde ; HB = 4-hydroxy-2'-bipyrole-5-carboxyaldéhyde.
Les objectifs de ce TP sont :
Observer et isoler des mutants pigmentaires de Serratia après exposition
à des agents mutagènes physiques, ici les UV.
Étudier l'action des UV en fonction du temps d'exposition : tracer
la courbe de destruction de Serratia
log(% survivants)=f(t).
Souches et milieux :
100 mL de culture de 18 heures de Serratia marcescens en BN
tubes de 9 ou 10 mL d'eau physiologique stériles
boîtes de milieu Mueller-Hinton (un milieu riche permet la croissance
des mutants auxotrophes)
Lampe UV proche UVPinc mineralight® modèle UVG-11 –
254 nm – 4 W et protection individuelle
Spectrophotomètre et cuve
JOUR 1 :
Mesurer l'absorbance à 600 nm de la culture initiale
de 18 heures de Serratia marcescens en bouillon.
Centrifuger 10 minutes à 4000 rpm 12 mL de culture
dans un Falcon de 15 mL pour culotter les cellules, les protéines
du milieu pouvant interférer avec l'action des UV (acides aminés
aromatiques).
Resuspendre le culot dans 12 mL d'eau physiologique
stérile et transférer dans une boîte de Pétri,
Déposer la boîte couvercle ouvert sur un
plateau oscillant sous une hotte à flux laminaire (PSM2),
Irradier avec des UV autour de 260 nm (lampe à
254 nm, maintenue à une distance comprise entre 10 et 20 cm constante
au dessus de la boîte) en prélevant des échantillons
à 0, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 80, 90 et 100 s. Porter une protection
contre les UV !
Réaliser des dilution décimales selon
le tableau suivant et étaler 0,1 mL de chaque sur les boîtes
de milieu.
Temps (s)
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
Dilutions 10-n
4-5-6
3-4-5
3-4-5
3-4-5
2-3-4
2-3-4
1-2-3
1-2-3
1-2-3
1
Incuber 48 h à température ambiante près
d'une fenêtre en évitant l'exposition directe (le pigment n'est
pas produit à 37°C : une température de 25-30°C est
optimale, et la production de pigment est augmentée en présence
de lumière.)
JOUR 2 :
Dénombrer les colonies de Serratia de type "sauvage" et
de type "mutées" (colonies plus petites, de type "R"
au lieu de type "S" et de pigmentation différente)
Réisoler les mutants pigmentaires sur de nouvelles boîtes.
Attention à ne pas confondre des contaminants avec des mutants apigmentés
!
Résultats :
Ramener l'ensemble des résultats pour une unité d'A600
initiale et tracer la courbe % survivants = f(t) et la droite log(%survivants)
= f(t).
En déduire la valeur du temps de réduction décimale
D.
Calculer le pourcentage de mutants observés en fonction du temps
Modélisation : %survivants=100*exp(-k*t)
La constante k dépend de la sensibilité du germe aux UV et de
l'Iradiance (en µW/cm²) qui dépend elle-même de la puissance
de la lampe (ici 4 W) et de la distance.
Le calcul de l'énergie met en évidence un certain nombre de paramètres
dont dépend cette énergie : la puissance de la source UV, P en
Watts, la surface émettrice S en m², le coefficient d'absorption
des rayons UV dans le liquide à traiter K en 1/m, l'épaisseur
de la lame d'eau Y en m, le temps d'exposition d'un élément de
volume T en s.
d'où : D (dose d'exposition) = P / S × exp(-KY)×T exprimée
en J/m²
