Aspect du test négatif

Aspect du test positif

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On utilise l’ONPG ou
Ortho-Nitro-Phényl-Galactopyranoside

Le test se pratique uniquement chez les bactéries lactose - en 24 h sur milieu solide.

A partir : de Kligler ou milieu lactosé BCP ou CLED...

• réaliser une suspension épaisse des bactéries testées en eau distillée.
• ajouter avec une pince flambée mais refroidie un disque imprégné d’ONPG.
• incuber 30 min à 37°C.
• lire

Cupule de la galerie API 20 E ONPG -thio-galactoside*

• Ensemencer avec la suspension d'une colonie en eau distillée (en général)
• Lecture identique à la technique classique

- une β-galactoside-perméase membranaire

- une β-galactosidase

- Milieu jaune : ONPG +

- Milieu sans couleur : ONPG -

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Ensemencer largement.

Incuber 24 h à t°C optimale.

Ajouter 10 gouttes d’alpha naphtol et le même volume de soude concentrée (ou de potasse).

Incliner le tube pour permettre une bonne oxygénation.

Attendre quelques min à 1 heure.

La réaction de Voges Proskauer (VP) consiste à mettre en évidence, par une réaction colorée, le butanediol et l'acétoïne.

- rouge : VP+

- jaune : VP-

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Ensemencer largement.

Incuber 24-48 h à t°C optimale.

Ajouter 2 à 3 gouttes de rouge de méthyle,

La lecture est immédiate

Mise en évidence des bactéries produisant des acides organiques  (éthanoïque...) par la voie des acides mixtes

- rouge : RM+

- jaune : RM-

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Faire une suspension en milieu Urée-tryptophane

Etuver

l'uréase, enzyme hydrolysant l’urée, activité directement détectable par le suivi de l'alcalinisation

La coloration rouge traduit une alcalinisation du milieu, suite à  l'hydrolyse de l'urée et formation de carbonate d'ammonium : uréase+

Si le milieu persiste orange alors pas d’alcalinisation test uéase -

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Faire une suspension en milieu Urée-tryptophane

Etuver

la tryptophanase, après addition du réactif de Kovacs. Le diméthyl-amino-4-benzaldéhyde contenu dans le réactif de Kovacs réagit avec l'indole, produit de l'activité de la tryptophanase, et forme un composé coloré en rouge.

- Formation d'un anneau rouge : indole +

- Absence de coloration rouge : indole - 

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Faire une suspension en milieu Urée-tryptophane

Etuver

la tryptophane désaminase (TDA), après addition de chlorure de Fer III. Le Fer III forme un complexe avec le produit de l'activité de la TDA, l'acide indole-pyruvique, complexe décelable par la formation d'un précipité marron

- Obtention d'un précipité brun foncé : TDA +

- Absence de précipité : TDA -.

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Le réactif peut se trouver sous deux formes :

- soit en solution : sur une lame de verre, déposer un carré de papier filtre et l’imbiber d’une solution fraîchement préparée de réactif,

- soit sous la forme d’un disque pré-imprégné par le réactif.

Dans les deux cas, écraser avec une effilure de pipette Pasteur une colonie de germes à étudier sur ce papier (instrument n’oxydant pas le réactif).

- La phénylène diamine oxydase

- Si la colonie prend une teinte rose, violette. Le germe possède une oxydase : le test est positif.

- Si la colonie reste incolore, le germe ne possède pas d’oxydase, le test est négatif.

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• Sur une lame propre et séche déposer une goutte eau oxygènée à 10 volumes,
• A l’aide d’une pipette Pasteur boutonnée, ajouter l’inoculum bactérien
• Observer immédiatement.
• Au contact d'une colonie isolée ou sur la pente d'une culture en gélose, déposer une goutte d'eau oxygénée
• Observer immédiatement.

- Apparition de bulles, dégagement gazeux de dioxygène : catalase +

- Pas de bulles : catalase –

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Faire une strie à la surface du milieu, ou éventuellement des touches. Incuber pendant 24 h ou plus à 37°C.

- la lipoprotéinase

- la lécithinase :

- Pour la lipoprotéinase on observe une clarification de la gélose autour de la strie d'ensemencement.

- Pour la lécithinase  l'action de la lécithinase libère de la choline soluble et un diglycéride peu soluble qui précipite dans le milieu provoquant un trouble dont les limites n'excèdent pas celles de la zone transparente précédente.

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Ensemencer le milieu de Moeller avec une goutte de suspension. Agiter (si le tube n'est pas plein le recouvrir de vaseline stérile). Fermer le tube entièrement afin de créer une anaérobiose relative. Mettre à l'étuve 24 heures à 37°C.

Les décarboxylases

- une bactérie non décarboxylante utilisera les peptones du milieu, et produira des acides organiques ainsi que des bases faibles comme l'ammoniac.  Le milieu deviendra jaune.

- une bactérie décarboxylante après avoir utilisé le glucose va produire du dioxyde de carbone et des amines. L'alcalinité des amines est importante, et le virage de l'indicateur de pH sera obtenu : le milieu restera violet.

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La recherche va s’effectuer :

• soit à partir de milieu gélosé nitraté,
• soit à partir de bouillon nitraté à 10 g.dm^-3,
• soit à partir du milieu mannitol mobilité,
• cupule GLU galerie API 20E.

 Après lecture des milieux, ajouter à la surface du milieu 3 gouttes d’acide sulfanilique puis 3 gouttes d’alpha naphtylamine.

Mélanger, observer.

Technique rapide

- réaliser une suspension très dense de la bactérie à étudier dans 0,5 mL de solution de nitrate potassium à 10 g/L

- incuber 2 h à 37°C

- ajouter 1 à 2 gouttes des réactifs , mélanger, observer.

- l’utilisation du zinc ne semble pas possible en un temps aussi court.

- Nitrate réductase

- Le milieu devient rouge : présence de nitrites. Donc la bactérie possède une nitrate réductase. Résultat NR+

- Le milieu reste inchangé : on ajoute alors de la poudre de zinc qui joue le même rôle que la nitrate réductase vis à vis des nitrates.

• coloration rouge : on a donc eu  transformation des nitrates en nitrites par le zinc. La bactérie ne possédait pas cette enzyme. Résultat NR-
• pas de coloration : les nitrates ont été transformés par la bactérie au delà des nitrites. La bactérie possède cette enzyme. Résultat NR+

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- Disposer d’un milieu Muller-Hinton en boite

- Réaliser une suspension de la souche à étudier de la façon suivante : dans 10 ml d’eau distillée stérile déposer selon la souche :

- 1 öse de culture liquide de 18 H (bacilles GRAM-)

- 1 goutte de culture liquide de 18 H (coques GRAM+)

- La suspension est alors opalescente

- Inonder la surface du milieu avec 2 ml de la suspension homogénéisée . Répartir uniformement.

- Réaspirer l’excédent d’inoculum.

- Sécher à l’étuve 15 min à 37°C

- Prélever le disque O129 stérilement avec une pince stérilisée

- Déposer ce disque à l’emplacement choisi.

- Appuyer légèrement sans enfoncer le disque pour faciliter l’adhérence du disque.

- Laisser 18 h à 30 ou 37°C

Résistance au composé vibriostatique O129 (2.4 diamino 6.7 diisopropylptéridine)

La culture doit être dense : les colonies jointives mais non confluentes.

Zone d’inhibition supérieur 15mm

Absence de zone d’inhibition

Coques gram +
- Staphylococcus résistant à O129
- Micrococcus  sensible à O129

Bacilles Gram - :
Vibrio     sensibles à O129
Aeromonas
Plesiomonas résistant à O129

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- Ensemencer massivement une gélose au sang.

- A l’aide d’une pince flambée, refroidie déposer un disque de bacitracine, dans la zone la plus dense de l’ensemencement.

- Incuber 24H à 37 °C

La culture doit être dense : les colonies jointives mais non confluentes.

Sensibilité à la bacitracine

Zone d’inhibition > à 12 mm  :  sensible à la bacitracine

Pas de zone d'inhibition : résistante

La souche étudiée correspondant à un S. b hémolytique est susceptible d’appartenir à l’espèce S. pyogenes Il faut confirmer par le sérogroupage.

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- Prendre un milieu de Todd Hewit de 18 h d’incubation ensemencé avec une colonie suspecte.

- Répartir en 2 tubes à hémolyse de 1 ml le bouillon étuvé.

- Ajouter dans l’un des 2 tubes 5 gouttes de desoxycholate et dans l’autre 5 gouttes d’eau physiologique stérile.

- Laisser 5 à 10 minutes à la température du laboratoire.

Si on observe un éclaicisssement dans l’essai : les bactéries ont été lysées.

Avec la sensibilité à l’optochine, la lyse par la bile permet de conduire à S. pneumoniae.

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- Ensemencer le milieu de culture avec la souche présumée de Streptococcus pneumoniae (colonie alpha hémolytique).

- A l’aide d’une pince flambée et refroidie, déposer un disque imprégné d’optochine dans la partie la plus dense de l’isolement, à 1.5 cm du bord de la boite.

- In cuber 24 H à 37 °C.

- Sensibilité à l’optochine pour S. pneumoniae

- zone d’inhibition >12 mm : sensible à l’optochine

- Pas de zone d'inhibition : résistant

Aspect avant ensemencement

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Dans un tube à hémolyse stérile, introduire 0,5 mL de plasma oxalaté + 0,5 mL  d’une culture de 18 h en bouillon coeur cervelle de la souche à étudier.

Placer le mélange à 37°C.

Des lectures doivent être effectuées toutes les heures au moins pendant les cinq premières heures.

- Coagulation du plasma => Coagulase + => Staphylococcus aureus.

- Pas de coagulation du plasma => Coagulase - => ininterprétable => faire d’autres tests (ADNase thermostable, recherche protéine A, recherche récepteur au fibrinogène).

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Déposer sur une lame parfaitement propre ou sur une carte à usage unique :

-  1 goutte de réactif test constitué de particules sensibilisées: latex ( ou hématies) ;

- 1 goutte de réactif humain constitué des mêmes particules non sensibilisées.

- Prélever à l'öse I à 2 colonies à identifier, les mettre soigneusement en suspension dans chacune des 2 gouttes.

Agiter d'un mouvement de lente rotation.

Vérifier l'absence d'agglutination avec le réactif témoin.

Observer l'apparition d'une agglutination massive des particules tests en moins de 30 secondes.

Ce test permet la mise en évidence de constituants, spécifiques de l'espèce S. aureus, présents à la surface des bactéries: récepteur de fibrinogène et/ou protéine A.

Une agglutination nette des particules tests, alors que la suspension témoin reste homogène indique que le staphylocoque étudié possède le récepteur du fibrinogène et/ou la protéine A, donc qu'il appartient à l'espèce S. aureus :

Réaction + : présence RF et/ou protéine A  alors conclure à l'espèce S. aureus.

Témoin pas d'agglutination

Une agglutination négative ou douteuse indique la nécessité de poursuivre l'identification: aucune concJusion ne peut être donnée.

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Test réalisé en boîte de Pétri contenant un milieu avec ADN et bleu de toluidine.

Chauffer 15 min à 100°C une culture de 24h en bouillon cœur-cervelle du staphylocoque étudié. Laisser refroidir.

Remplir de bouillon un puits de 4 mm de diamètre environ, préalablement creusé dans la gélose.

Incuber 4 h minimum à 37°C.

Réaliser en parallèle un puits témoin négatif rempli de bouillon stérile et un puits rempli de bouillon non chauffé.

L'ADNase.

L’apparition d’une teinte rose autour d’un puits révèle la libération des polynucléotides résultant de l’hydrolyse de l’ADN du milieu (le puits témoin négatif ne doit pas être cerné de rose).

Coloration rose : DNAse thermostable +

Coloration bleue : DNAse  thermostable -

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- Faire une suspension dense en eau physiologique additionnée d'ions calcium ou en eau peptonée

- Ajouter un morceau de film noir et blanc exposé et développé ou un disque de gélatine de Kahn

- Étuver

- Lire après 24, 48 h...

La gélatinase ou collagénase

Suspension de particules noires libérées du film ou du disque : Gélatinase+

Disque ou film intact éclaircissement du film : Gélatinase-

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Ensemencer abondamment un tube de 10 mL de bouillon MRS (ou un milieu spécial de Gibson Abdel Malek)

Recouvrir la surface du liquide d’une couche de paraffine.

Incuber à 37 °C durant 2 à 7 jours.

La production de dioxyde de carbone conduit au soulèvement du bouchon de paraffine au dessus de la surface du milieu

Production de gaz : espèce hétérofermentaire

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- faire une strie de Staphylococcus aureus productrice de toxine staphylococcique sur une gélose au sang de mouton,

- faire une strie de la souche à tester s’arrêtant à 5 mm de la strie.

- Incuber 24h en aérobiose,

- Observer.

- l'autre avec la souche de streptocoques à identifier. Un disque imprégné de toxine staphylococcique peut aussi être utilisé: il est alors placé dans le prolongement de la strie du streptocoque, à quelques millimètres de celle-ci.

Un Camp-test positif se traduit par l'observation d'un croissant d'hémolyse franche à bords nets entre le disque et la strie du streptocoque ou dans la zone d'intersection des deux stries.

Zone d'hémolyse complète, la toxine augmente le pouvoir hémolytique des streptocoque : camp test +

Zone d’hémolyse incompléte la toxine β du Staphylococcus n’augmente pas  le pouvoir du streptocoque Camp test -