Les milieux de culture en microbiologie

(c) Copyright P.Y. Guillaume 2004

Merci à Isabelle Darinot et Véronique Serventon pour leur aide.

L'utilisation des photos et documents ne peut s'effectuer que dans un cadre pédagogique et non lucratif.

Le milieu de Chapman est un milieu sélectif, surtout utilisé en microbiologie médicale, permettant la croissance des germes halophiles. Parmi ces germes figurent au premier rang les bactéries du genre Staphylococcus, mais aussi les Micrococcus, les Enterococcus, les Bacillus, et de rares bactéries à Gram négatif.

Aspect du milieu avant utilisation	Mode d’ensemencement	Sélectivité / composition	Caractères recherchés	Résultats

	L'ensemencement doit être massif, en stries serrées ou par inondation	Ce milieu contient un inhibiteur : fortes concentrations en chlorure de sodium (75 g.L^-1), ce qui permet un isolement sélectif de Staphylococcus tolérant les fortes concentrations en NaCl	On peut étudier la fermentation du mannitol par virage au jaune de l’indicateur coloré, le rouge de phénol, autour des colonies.	Les colonies mannitol + sont entourées d’une auréole jaune. Ne pas confondre la pigmentation des colonies et le virage de l’indicateur coloré. Ainsi des colonies pigmentées en jaunes et mannitol + : forte suspicion de S. aureus
Aspect du milieu après utilisation

- Milieu Hektoen

La gélose Hektoen est un milieu d'isolement des Salmonelles et des Shigelles, bien que de nombreuses bactéries à Gram négatif puissent se développer sur ce milieu. L'identification d'entérobactéries pathogènes repose sur la non utilisation des glucides présents dans le milieu.

Aspect du milieu avant utilisation	Mode d’ensemencement	Sélectivité / composition	Caractères recherchés	Résultats

	L'ensemencement se fait par les techniques habituelles.	Deux indicateurs sont présents dans le milieu : - le bleu de bromothymol (indicateur de pH) - la fuschine acide (qui se colore en présence d'aldéhyde.	trois types de glucides : la salicine (qui est un hétéroside), le saccharose et le lactose. La production d'H₂S à partir de thiosulfate	Colonies saumon : Escherichia, Levinea, Citrobacter diversus, Klebsiella, Enterobacter, Serratia, Yersinia Colonies saumon à centre noir : Citrobacter freundii, Proteus vulgaris, Colonies bleu-vert à centre noir : Suspicion de *Salmonella, à différencier de Proteus mirabilis* Colonies bleu-vert ou vertes : Suspicion de *Shigella* ou de *Salmonella*
Aspect du milieu après utilisation

- Gélose SS

Gélose Salmonella-Shigella.

Milieu sélectif permettant l’isolement d'entérobactéries pathogènes.

Il est très utilisé pour la recherche de Salmonella dans les selles et les denrées alimentaires peu pour les Shigella car trop sélectif.

Aspect du milieu avant utilisation	Mode d’ensemencement	Sélectivité / composition	Caractères recherchés	Résultats

	Isolement par la méthode des cadrans. Incuber 18 à 24 h à 37°C.	Le milieu contient 3 inhibiteurs : - sels biliaires, - vert brillant - forte concentration en citrate de sodium. Ceux-ci empêchent la pousse de toutes bactéries Gram⁺, et rendent difficile la croissance des bactéries Gram^- autres que Salmonella et Shigella.	Le milieu contient du lactose pouvant être fermenté. Le milieu contient du thiosulfate pouvant donner du H₂S.	colonies rouges : lactose + colonies incolores : lactose– colonies à centre noir : H2S +
Aspect du milieu après utilisation

- Milieu EMB

Milieu Eosine Bleu de Méthylène.

Milieu d'isolement des bacilles Gram^-.

Il est très utilisé pour l’isolement des coliformes.

Aspect du milieu avant utilisation	Mode d’ensemencement	Sélectivité / composition	Caractères recherchés	Résultats

	Isolement par la méthode des cadrans.	Ce milieu contient deux colorants, l’éosine et le bleu de méthylène qui inhibent la majeure partie de la flore Gram⁺ (sauf Streptocoques D). Bien que les Entérobactéries lactose - puissent s’y développer, la culture des Entérobactéries lactose + y est favorisée.	Le milieu contient un critère de différenciation, le lactose	colonies violettes : semi-bombées de 2 à 3mm de diamètre avec éclat métallique, centre sombre : E. coli très bombées muqueuses de diamètre 5 mm centra gris marron sans reflet Klebsiella colonies grisâtres : - 1 à 2 mm de diamètre transparentes, grises ambrées : Salmonella, Shigella. - 2 mm de diamètre, grisâtres avec une pellicule autour de la colonie : Proteus morganii punctiformes et grisâtres : Enterococcus.
Aspect du milieu après utilisation

- Milieu Mac Conkey

Milieu sélectif pour l'isolement des bacilles Gram^- Salmonella et Shigella ainsi que des bactéries coliformes dans les eaux, les produits alimentaires, les produits pharmaceutiques et biologiques .

Aspect du milieu avant utilisation

Aspect du milieu après utilisation

Mode d’ensemencement

Sélectivité / composition

Caractères recherchés

Résultats

Isolement par la méthode des cadrans.

Incuber 18 à 24 h à 37 °C.

Ce milieu contient deux inhibiteurs de la flore Gram⁺ :

- les sels biliaires

- le cristal violet

le lactose dont l’utilisation est révélée par l’indicateur coloré du milieu, le rouge neutre.

colonies rouges entourées d’un hâlo opaque de la même couleur du à la précipitation des sels biliaires: lactose⁺

colonies jaunes ou incolores : lactose^-

- Milieu CLED

Le milieu CLED (Cystine Lactose Electrolyte Déficient) est un milieu non sélectif, très utilisé dans l'étude des bactéries contenues dans l'urine. Etant un milieu non sélectif de nombreuses bactéries, tant Gram + que Gram -, pourront se développer.

L’absence d’électrolytes (pas de NaCl) limite le phénomène d’envahissement par les Proteus.

Aspect du milieu avant utilisation

Aspect du milieu après utilisation

Mode d’ensemencement

Sélectivité / composition

Caractères recherchés

Résultats

La lecture s'effectue après 18 à 24 heures d'incubation à 37°C.

Lactose

lactose + apparaissent jaunes

lactose – apparaissent bleues vertes

- Milieu BCP

C’est un milieu utilisé pour la détection et l’isolement des entérobacteriacées dans l’eau, les produits alimentaires, l’urine et les selles

Ce milieu facilite la différenciation des colonies par le caractère lactose. Il inhibe l’envahissement de la surface de la boite par des nappes de Proteus car il ne contient pas d'électrolytes.

C’est un milieu non sélectif qui est utilisé pour l’isolement de nombreuses espèces n’appartenant pas aux entérobactéries.

C’est un milieu contenant une base nutritive ordinaire permettant la pousse des bactéries non exigeantes.

Il contient un critère de différenciation : la fermentation du lactose révélée par le virage en milieu acide de l’indicateur coloré de pH, le bromocrésol pourpre.

Il est déficient en électrolytes : absence d'ions minéraux.

Aspect du milieu avant utilisation

Aspect du milieu après utilisation

Mode d’ensemencement

Sélectivité / composition

Caractères recherchés

Résultats

Isolement

18 à 24 h à 37°C

- Non selectif

- Dépourvu en électrolyte

- Bromocrésol pourpre

- Espèces n’appartenant pas aux entérobactéries

- Fermentation du lactose

Colonies bleues : bactéries lactose –

Colonies jaunes : bactéries lactose +

- Milieu Baird Parker

Recherche et dénombrement de Staphylococcus aureus

Ce milieu contient une base nutritive riche.

Il contient des accélérateurs de la croissance : le pyruvate de sodium et le glycocolle

Aspect du milieu avant utilisation

Aspect du milieu après utilisation

Mode d’ensemencement

Sélectivité / composition

Caractères recherchés

Résultats

Isolement

18 à 24 h à 37°C

Il contient 2 inhibiteurs :

le chlorure de lithium

le tellurite de potassium.

Contient 3 critères de différenciation :

réduction du tellurite

protéolyse des protéines du jaune d'œuf

hydrolyse par une lécithinase des lécithines du jaune d'œuf

- en tellure noir

- halo clair autour de la colonie

- liseré blanc opaque autour de la colonie

- Milieu BEA

Milieu d'isolement sélectif des Streptocoques D (entérocoques et non entérocoques).

Aspect du milieu avant utilisation

Aspect du milieu après utilisation

Mode d’ensemencement

Sélectivité / composition

Caractères recherchés

Résultats

Le milieu présenté en boite de Pétri est destiné à un isolement.

Le milieu présenté en tube est à beurrer avec une culture pure car il entre dans la galerie d’identification des coques gram + de culture facile.

C’est un milieu sélectif des streptocoques peu exigeants.

Il contient 2 inhibiteurs :

- la bile de bœuf

- l’azide de sodium

l’esculine révélée par le citrate de fer ammoniacal

Pousse de petites colonies sur le milieu : Streptocoques D

Colonies entourées d'un halo noir : esculine +

- Gélose au sang

C’est un milieu d’isolement enrichi sur lequel les Streptocoques se développent bien. Il permet, la lecture du caractère hémolytique.

C’est un milieu riche d’autant plus par la présence de sang.

Aspect du milieu avant utilisation

Aspect du milieu après utilisation

Mode d’ensemencement

Caractères recherchés

Résultats

Isolement

18 à 24 h à 37°C

Hémolyse

Hémolyse b : zone claire d’hémolyse totale de diamètre 3-4 mm entourant les colonies.

Hémolyse a : zone floue et granuleuse, verdâtre de 1 à 2 mm de diamètre

- Milieu Slanetz

Milieu de dénombrement des entérocoques en microbiologie alimentaire. Son emploi est surtout réservé aux eaux, après filtration.

Aspect du milieu avant utilisation

Aspect du milieu après utilisation

Mode d’ensemencement

Sélectivité / composition

Caractères recherchés

Résultats

Isolement

Filtration

Il contient un inhibiteur des gram -, qui sélectionne les Streptocoques : l’azide de sodium.

le TTC qui lors de sa réduction donne une coloration des bactéries en rouge.

Les Entérocoques donnent des colonies de taille moyenne, roses ou rouges.

Les Bacillus peuvent pousser et donner le même aspect de colonies, mais de taille plus importante.

- Milieu Cétrimide

La gélose au cétrimide est un milieu sélectif, qui permet l'isolement des Pseudomonas et notamment de P.aeruginosa. Ce milieu gélosé est relativement pauvre, et contient un antiseptique: le cétrimide (bromure de N-cétyl-N, N, N-triméthylammonium). Ce milieu, proche du milieu King A, favorise aussi la production de pigments par P.aeruginosa.

Aspect du milieu avant utilisation	Mode d’ensemencement	Sélectivité / composition	Caractères recherchés	Résultats

	Ensemencer la surface du milieu au moyen de l'anse. Incuber durant 24 heures à 37°C, voire même de préférence à 42°C (l'incubation à 42°C permet un isolement spécifique de P.aeruginosa).	Sur ce milieu de très nombreuses bactéries sont inhibées de par la présence de l'antiseptique cétrimide(bromure de N-cétyl-N, N, N-triméthylammonium)., ainsi que par la présence de l'antibiotique acide nalidixique (inhibiteur de nombreuses bactéries à Gram négatif).	-pyoverdine -pyocyanine	Milieu bleu : pyocyanine Milieu jaune- vert : pyoverdine
Aspect du milieu après utilisation

- Gélose Sabouraud

La gélose de Sabouraud constitue un milieu classique pour la culture, l'isolement et l'identification des levures et des moisissures saprophytes ou pathogènes.

Elle est recommandée essentiellement pour l'isolement des moisissures dans les prélèvements peu chargés en bactéries, les contrôles de stérilité des produits pharmaceutiques, cosmétiques ou alimentaires, la culture des moisissures en vue de réaliser leur identification.

Dans le cas de prélèvements fortement contaminés, il est préférable d'utiliser la gélose Sabouraud + chloramphénicol .

Aspect du milieu avant utilisation	Mode d’ensemencement	Sélectivité / composition

	- Transférer l'échantillon à analyser sur le milieu. - Etaler l'inoculum en surface à l'aide d'un étaleur en verre stérile. - Incuber à 20 - 25°C de 3 à 5 jours.	L'ajout de triphényltétrazolium à raison de 100 mg par litre en fait un milieu de différenciation pour les Candida.
Aspect du milieu après utilisation

- Gélose Sabouraud plus chloramphénicol

Aspect du milieu avant utilisation	Mode d’ensemencement	Sélectivité / composition	Caractères recherchés

	- Transférer l'échantillon à analyser sur le milieu. - Etaler l'inoculum en surface à l'aide d'un étaleur en verre stérile. - Incuber à 20-25°C de 3 à 5 jours.	Chloramphénicol	Recherche des champignons
Aspect du milieu après utilisation

- Gélose CIN

Milieu d'isolement sélectif des Streptocoques D (entérocoques et non entérocoques).

Aspect du milieu avant utilisation	Mode d’ensemencement	Sélectivité / composition	Caractères recherchés	Résultats

	Isolement.	2 inhibiteurs permet de sélectionner la culture des streptocoques du groupe D.: - la bile de bœuf - l’azide de sodium	l’esculine révélée par le citrate de fer ammoniacal	Pousse de petites colonies sur le milieu : Streptocoques D Colonies entourées d'un halo noir : esculine +
Aspect du milieu après utilisation

- Gélose au lait

Aspect du milieu avant utilisation	Mode d’ensemencement	Sélectivité / composition	Caractères recherchés	Résultats

	Faire une strie centrale à la surface du milieu. Incuber 24H à 7jours à la température désirée.		l’hydrolyse de la caséine	L’hydrolyse de la caséine se traduit par l’apparition d’une zone claire autour de la culture.
Aspect du milieu après utilisation

- Gélose à l’amidon

Aspect du milieu avant utilisation	Mode d’ensemencement	Sélectivité / composition	Caractères recherchés	Résultats

	Ensemencer par une strie à la surface du milieu. Incuber un à huit jours à la température désirée.		l’hydrolyse de l’amidon.	Hydrolyse mise en évidence par l’ajout d’une solution iodée : - une coloration bleu-rouge due à l’amidon, montre qu’il n’a pas été hydrolysé - la disparition de cette coloration montre son hydrolyse.
Aspect du milieu après utilisation

- Gélose à l’oeuf

Aspect du milieu avant utilisation	Mode d’ensemencement	Sélectivité / composition	Caractères recherchés	Résultats

	Faire une strie à la surface du milieu, ou éventuellement des touches. Incuber pendant 24 h ou plus à 37°C.		La lécithinase	l'action de la lécithinase libère de la choline soluble et un diglycéride peu soluble qui précipite dans le milieu provoquant un hâlo autour de la culture
Aspect du milieu après utilisation

- Gélose Drigalski

Milieu sélectif permettant l’isolement des bactéries Gram^- non exigeantes. Il est utilisé pour l’isolement des germes urinaires et pour la coproculture

Aspect du milieu avant utilisation	Mode d’ensemencement	Sélectivité / composition	Caractères recherchés	Résultats

	Isolement par la méthode des cadrans.	Contient deux inhibiteurs de la flore Gram⁺: - le désoxycholate de sodium - le cristal violet	Fermentation du lactose	Les colonies de bactéries lactose + sont jaunes. Celles de bactéries lactose – sont bleues.
Aspect du milieu après utilisation

- Gélose TSN

Milieu de dénombrement des anaérobies sulfito-réducteurs (spores de Clostridium sulfito-réducteurs et Clostridium perfringens) dans les produits alimentaires.

Aspect du milieu avant utilisation

Aspect du milieu après utilisation

Mode d’ensemencement

Sélectivité / composition

Caractères recherchés

Résultats

Isolement

L’incubation se fait en anaérobiose.

La température d’incubation permet de sélectionner les diférents types bactérien.

Réduction par le fer du sulfite de sodium

- les anaérobies sulfito-réducteurs : à 37°C

- Clostridium perfringens à 46°C

Colonies rouges : colonies sulfito réductrices

- Gélose TCBS

Aspect du milieu avant utilisation	Mode d’ensemencement	Sélectivité / composition	Caractères recherchés	Résultats

	Ensemencer à partir de la selle. Incuber 24 heures à 37°C.	La forte concentration en bile et en citrate, associée à un pH élevé (pH = 8,6) permet l'élimination de nombreuses bactéries	Recherche et l'isolement des vibrions pathogènes présents dans les prélèvements poly microbiens	- Colonies jaunes (Vibrions saccharose +) - Colonies vertes (Vibrions saccharose -) - Petites colonies jaunes - Petites colonies vertes Colonies à centre noir : colonies H₂S +.
Aspect du milieu après utilisation

- Gélose à l’ADN

Aspect du milieu avant utilisation	Mode d’ensemencement	Sélectivité / composition	Caractères recherchés	Résultats

	Percer la gélose de trous. Inoculer avec quelques gouttes d'un bouillon creurcervelle ensemencé auparavant et bouilli 10 minutes. Incuber 4 heures à 37 oC.		la DNase thermo résistante de Staphylococcus	halo rose signant la DNase autour des trous percés sur le fond bleu de la gélose
Aspect du milieu après utilisation

- Gélose lactosée au désoxycholate 0.1%

Milieu de dénombrement des coliformes en microbiologie alimentaire (analyse des eaux et des aliments).

Aspect du milieu avant utilisation	Mode d’ensemencement	Sélectivité / composition	Caractères recherchés	Résultats

	- Isolement	2 inhibiteurs des bactéries Gram⁺ à faible concentration : - le désoxycholate (sels biliaires) - le citrate de sodium.	le lactose	Colonies rouges : bactéries lactose⁺ , coliformes Colonies incolores : bactéries lactose^-
Aspect du milieu après utilisation

- Milieu Muller Hinton

Aspect du milieu avant utilisation

Aspect du milieu après utilisation

Mode d’ensemencement

Sélectivité / composition

Caractères recherchés

Résultats

selon le cas :

- isolement

- ensemencement en nappe avec inoculum

L’amidon neutralise les inhibiteurs apportés par la gélose

Sensibilité au antibiotiques et au composé O 129

- Gélose nutritive ordinaire

Aspect du milieu avant utilisation	Mode d’ensemencement	Sélectivité / composition	Caractères recherchés	Résultats

	Ensemencement par isolement.		Ces milieux permettent la culture des bactéries peu exigeantes	- Certaines colonies peuvent avoir des couleurs caractéristique.
Aspect du milieu après utilisation

- Milieu Todd Hewit

Ce milieu glucosé tamponné convient bien à la culture des bactéries exigeantes supportant mal les variations de pH, il est bien adapté à la culture des Streptocoques.

Aspect du milieu avant utilisation	Aspect du milieu après utilisation	Mode d’ensemencement	Sélectivité / composition	Caractères recherchés	Résultats

		Ensemencement par isolement.	système tampon (phosphates, bicarbonates) permet d’empêcher que l’acide formé par le métabolisme du glucose n’exerce une action nuisible sur les bactéries

- Milieu TTC tergitol

Milieu de recherche et de dénombrement des coliformes. Il est surtout utilisé pour la colimétrie des eaux par la méthode de filtration.

Aspect du milieu avant utilisation	Mode d’ensemencement	Sélectivité / composition	Caractères recherchés	Résultats

	Filtration	le Tergitol 7 permettant de sélectionner les coliformes et inhibe aussi l’envahissement par Proteus	- le TTC qui montre le pouvoir réducteur des bactéries - le lactose dont l’utilisation est révélée par le virage du bleu de bromothymol	- colonie rose-rouge : réduction du TTC - colonie jaune : absence de réduction du TTC - halo bleu-vert : lactose – - halo jaune : lactose + E. coli et Enterobacter aerogenes donnent des colonies jaunes Les autres coliformes donnent des colonies rouges.
Aspect du milieu après utilisation

- Gélose au sang cuit

C’est un milieu d’isolement enrichi préconisé pour l’étude des Neisseria notamment le méningocoque. Il est aussi utilisé pour la culture de Haemophilus influenza.

Aspect du milieu avant utilisation	Mode d’ensemencement	Sélectivité / composition	Caractères recherchés	Résultats

	- Isolement	L’amidon de maïs neutralise les substances toxiques libérées par les cultures.
Aspect du milieu après utilisation

- Gélose Mossel

Milieu utilisé en alimentaire pour l’isolement de Bacillus cereus.

Aspect du milieu avant utilisation	Mode d’ensemencement	Sélectivité / composition	Caractères recherchés	Résultats

	Etaler une goutte de produit à éudier et au rateau, avec des billes ou par inodation	Assuré par la polymyxine qui inhibe ou retarde la croissance d’autre espèces.	Croissance ou absence croissance de colonie mannitol – lécthinase +	Si il y a croissance alors présence de la souche Bacillus cereus : colonie - roses rouges (mannitol -) - halo blanchâtre au centre de la colonie (lécithinase +)
Aspect du milieu après utilisation

- Milieu Hajna-Kligler

Le milieu de Hajna-Kligler est un milieu complexe, qui permet la recherche de plusieurs caractères biochimiques. Il est très utilisé dans l'identification des Enterobacteriaceae.

Aspect du milieu avant utilisation

Aspect du milieu après utilisation

Mode d’ensemencement

Sélectivité / composition

Caractères recherchés

Résultats

Ensemencer abondamment la surface par stries serrées ou par inondation, puis le culot par simple piqûre, à l'aide de la même pipette boutonnée. Il est important de ne pas oublier de dévisser partiellement la capsule afin de permettre les échanges gazeux.

Mettre à l'étuve 24h à 37°C.

Utilisation du glucose

Utilisation du lactose

Production H₂S

Production de gaz

Recherche de la LDC

a) Bactérie de type fermentatif du glucose et lactose + : culot jaune et pente jaune.

b) Bactérie de type fermentatif du glucose et lactose - : culot jaune et pente rouge.

c) Bactérie de type oxydatif du glucose ou glucose - et lactose - : culot rouge et pente rouge.

d) Bactérie de type oxydatif du glucose et lactose + : culot rouge et pente jaune. Ces bactéries sont aérobies strictes : le culot ne doit pas présenter de culture et sera donc rouge. La pente peut présenter une culture et sera jaune si l'acidification est suffisante et rouge dans le cas contraire. Le milieu de Kligler n'est généralement pas utilisé pour de telles bactéries, qui sont souvent lactose -, et des expériences complémentaires sont faites pour préciser le résultat.

- Milieu Lysine Fer

Ce milieu peut être utilisé en routine mais il est généralement utilisé pour l’identification des souche de Salmonella.

Aspect du milieu avant utilisation

Aspect du milieu après utilisation

Mode d’ensemencement

Sélectivité / composition

Caractères recherchés

Résultats

Pratiquer l’ensemencement la pente ave des stries et le culot par piqure centrale

La lysine désaminase (LDA)

La lysine décarboxylase (LDC)

La production d’H₂S

Pente violette, culot jaune : bactérie LDA -, LDA -, H₂S –

Pente violette, culot violet : bactérie LDA – LDC +, H₂S - , K. pneumoniae, K. oxytoca, Enterobacter (sauf cloacae), Serratia, E. coli, S. typhi.

Pente violette, culot jaune : bactéries LDA -, LDC – H₂S – ou + Escherichia, Shigella, E. cloacae, K. rhinoscleromatis, Citrobacter, S. parathyphi A, Yersinia, Levinea, E. coli (biotype LDC -)

Pente violette, culot violet avec noircissement : bactérie LDA – LDC +, H₂S + , Salmonella H₂S + y compris S. arizonae, Edwardsiella

Pente rouge vineux, culot jaune : bactéries LDA +, LDC – H₂S – ou + Proteus Providencia

- Milieu citrate de Simmons

Ce milieu est un exemple de milieu synthétique, c'est à dire de milieu dont la composition, qui est complexe, est connue exactement tant qualitativement que quantitativement

Aspect du milieu avant utilisation

Aspect du milieu après utilisation

Mode d’ensemencement

Sélectivité / composition

Caractères recherchés

Résultats

La pente est ensemencée par une strie longitudinale, réalisée à l'anse, à partir d'une suspension de la culture solide en eau distillée stérile.

Il est important de ne pas apporter de substrats carbonés. Ainsi l'ensemencement à partir d'une souche pure fournie en bouillon nutritif ou en eau peptonée est impossible.

Ne pas visser le bouchon à fond, afin de permettre les échanges gazeux (en particulier élimination du dioxyde de carbone).

Mettre à l'étuve 24 heures à 37°C.

Utilisation du citrate comme seule source de carbone

- Virage de l'indicateur de pH au bleu : il y a eu alcalinisation du milieu et la souche est citrate de Simmons +.

- Pas de virage de l'indicateur de pH : il n'y a pas eu alcalinisation et le milieu ne présente pas de culture. La souche est citrate de Simmons -.

- Milieu phénylalanine

Milieu utilisé pour la recherche de la phénylalanine désaminase. Le phénylpyruvate donne une teinte verte en présence de fer III.

Aspect du milieu avant utilisation

Aspect du milieu après utilisation

Mode d’ensemencement

Sélectivité / composition

Caractères recherchés

Résultats

La pente par épuissement

La PDA : phénylalanine désaminase

Pente verte après ajout de perchlorure de fer : PDA +

Pente inchangée après ajout de perchlorure de fer : PDA -

- Milieu Clark et Lubs

Ce milieu permet l’étude de la voie de fermentation du glucose.

Aspect du milieu avant utilisation

Aspect du milieu après utilisation

Mode d’ensemencement

Sélectivité / composition

Caractères recherchés

Résultats

Ensemencer largement.

Incuber 24 h à t°C optimale.

* test VP :

- ajouter 10 gouttes d’alpha naphtol et le même volume de soude concentrée (ou de potasse).

- incliner le tube pour permettre une bonne oxygénation.

- attendre quelques min à 1 heure.

* test RM :

- ajouter 2 à 3 gouttes de rouge de méthyl,

- la lecture est immédiate.

soit de nombreux acides par la voie des fermentations acides mixtes qui sont mis en évidence par le test RM (au rouge de méthyl),

soit d’acétoïne produit par fermentation butanediolique qui est mise en évidence par le test VP (Voges-Proskauer)

Test VP :

- rouge : VP+

- jaune : VP-

Test RM

- rouge : RM+

- jaune : RM-

- Milieu viande-foie

L'étude du type respiratoire d'une bactérie (c'est à dire ses rapports avec l'O ₂) nécessite un milieu de culture riche contenant un gradient de pression partielle en di-oxygène.

Le principal milieu utilisé à cette fin est la gélose viande-foie (gélose VF).

Aspect du milieu avant utilisation

Aspect du milieu après utilisation

Mode d’ensemencement

Sélectivité / composition

Caractères recherchés

Résultats

- régénérée la gélose VF par ébullition au bain-marie bouillant pendant environ 30 minutes.

- ensemencer lorsque le milieu est encore liquide, vers 45°C. L'ensemencement se fait à la pipette Pasteur scellée (ou boutonnée) et chargée. On introduit la pipette Pasteur au fond du tube et on remonte en spirale.

Ne pas visser le bouchon à fond, sinon on empêche la formation du gradient de O2.

- refroidir à l’eau courante,

- on place ensuite le tube à l'étuve (à 37°C) pendant 24 heures.

Type aérobie strict : culture seulement en présence de di-oxygène.

Type aéro-anaérobie : culture en présence et en absence de di-xoygène. La technique utilisée ne permet pas de différencier entre les bactéries aéro-anaérobies facultatives et les bactéries anaérobies aéro-tolérantes. On conclut type aéro-anaérobie.

Type anaérobie strict : culture uniquement en l'absence de di-oxygène.

Type micro-aérophile : culture seulement dans une zone de pression faible en di-oxygène.

- Tube Yvan Hall

Aspect du milieu avant utilisation	Aspect du milieu après utilisation

- Milieu Hugh et Leifson

De l'étude du métabolisme énergétique il découle que un glucide peut être catabolisé par voie respiratoire ou par voie fermentative. Le milieu de Hugh et Leifson permet de distinguer entre les deux processus.

La dégradation d'un glucide s'accompagne généralement d'une acidification du milieu :

- lors des respirations le glucide est oxydé en CO₂, par le dioxygène (ou un autre oxydant minéral);

- Lors des fermentations le glucide est oxydé en acides, alcools, qui sont libérés dans le milieu qu'ils acidifient sensiblement. Toutes les voies fermentaires ne sont cependant pas également acidifiantes.

Aspect du milieu avant utilisation	Aspect du milieu après utilisation	Mode d’ensemencement	Sélectivité / composition	Caractères recherchés	Résultats

		- Régénérer le milieu au bain-marie bouillant. Ramener à 45-50°C. - Ajouter aseptiquement le glucide étudié (ici le glucose) pour obtenir une concentration finale de 1%. - Agiter (l'agitation doit être douce pour éviter l'entrée d'air) et laisser le milieu se solidifier (en le passant sous l'eau froide par exemple). - Ensemencer par piqûre centrale. - Ne pas revisser à fond le bouchon. - Mettre à l'étuve.	Le milieu de Hugh et Leifson contient un indicateur de pH, le bleu de bromothymol , qui prend une couleur jaune en milieu acide.	Ce milieu permet de déterminer la voie d'attaque des glucides, comme par exemple le glucose. Mobilité	- les bactéries fermentatives - les bactéries oxydatives (qui oxydent le glucide par respiration aérobie) - les bactéries inactives ou inertes

- Mannitol-mobilité

Ce milieu permet l’étude de la dégradation du mannitol qui est un produit de dégradation du mannose.

Aspect du milieu avant utilisation

Aspect du milieu après utilisation

Mode d’ensemencement

Sélectivité / composition

Caractères recherchés

Résultats

Ensemencer par piqûre centrale à l’aide d’un fil droit.

Incuber 24 h à T° optimale.

R : ce milieu est utilisable uniquement pour les bactéries fermentatives.

Mannitol

Mobilité

Nitrate réductase

- Caractère mannitol

- milieu jaune : Mannitol +

- milieu rouge : Mannitol –

- La mobilité : Les bactéries très mobiles peuvent se déplacer dans la gélose molle : étude de la mobilité.

- Nitrate réductase :

- Tubes Falkow

Aspect du milieu avant utilisation

Aspect du milieu après utilisation

Mode d’ensemencement

Sélectivité / composition

Caractères recherchés

Résultats

Pour les bactéries Gram– AAF à métabolisme fermentatif (Enterobacteriaceae et Vibrionaceae) : la lecture s'effectue après 4 jours à 37 ou 30 ou 22°C.

Pour les bactéries Gram – AS à métabolisme oxydatif (Pseudomonas, Flavobacterium, Xanthomonas, Alcaligenes, Moraxella, Acinetobacter) : la lecture s'effectue après 24 à 48 h à 30 °C.

- LDC : lysine décarboxylase

- ADC : arginine décarboxylase

- ODC : ornithine décarboxylase…

… selon l’acide aminé ajouté au milieu

Virage au jaune (acide) décarboxylase –

Virage au violet (basique) décarboxylase +

Animation Flash

- Tubes Möller

Aspect du milieu avant utilisation

Aspect du milieu après utilisation

Mode d’ensemencement

Sélectivité / composition

Caractères recherchés

Résultats

Pour les bactéries Gram– AAF à métabolisme fermentatif (Enterobacteriaceae et Vibrionaceae) : la lecture s'effectue après 4 jours à 37 ou 30 ou 22°C.

Pour les bactéries Gram – AS à métabolisme oxydatif (Pseudomonas, Flavobacterium, Xanthomonas, Alcaligenes, Moraxella, Acinetobacter) : la lecture s'effectue après 24 à 48 h jours à 30 °C.

- LDC : lysine décarboxylase

- ADC : arginine décarboxylase

- ODC : ornithine décarboxylase…

… selon l’acide aminé ajouté au milieu

Virage au jaune (acide) décarboxylase –

Virage au violet (basique) décarboxylase +

- Milieu PCB

Aspect du milieu avant utilisation	Aspect du milieu après utilisation	Mode d’ensemencement	Sélectivité / composition	Caractères recherchés	Résultats

- Milieu King A et King B

Les milieux de King (milieu King A et milieu King B permettent de différencier entre elles les différences espèces du genre Pseudomonas, par la mise en évidence de la production de pigments spécifiques.

L'élaboration des pigments est influencée par la composition du milieu, ce qui justifie l'utilisation de deux milieux différents : King A et King B.

Aspect du milieu avant utilisation

Aspect du milieu après utilisation

Mode d’ensemencement

Sélectivité / composition

Caractères recherchés

Résultats

- A partir d'une culture sur gélose (faire une suspension en eau distillée) ou dans un bouillon, ensemencer le milieu en faisant une strie à la surface de la gélose avec l'anse (ou en déposant une goutte de suspension).

- L'incubation est réalisée en aérobiose.

la production de pyocanine, due spécifiquement à Pseudomonas aeruginosa, est favorisée par la présence d'ions inorganiques. La recherche de la production de pyocyanine est effectuée sur milieu King A.

la production de pyoverdine, est favorisée par une teneur élevée en phosphate. La recherche de la production de pyoverdine est effectuée sur milieu King B.

- couleur bleue sur le milieu King A (présence de pyocyanine)

- couleur jaune-vert fluorescent sur le milieu King B (présence de pyoverdine) sous UV.

- Bouillon cœur-cervelle

Milieu de mise en évidence de la respiration sur nitrates, par recherche de la nitrate réductase (NR).

Aspect du milieu avant utilisation

Aspect du milieu après utilisation

Mode d’ensemencement

Sélectivité / composition

Caractères recherchés

Résultats

Introduire quelques gouttes de culture liquide à la pipette Pasteur, ou une oese de culture solide, dans le bouillon

Homogénéiser.

Incuber 24 heures à 37°C.

Test nitrate-réductase

Voir NR

- Gélose PCA

La gélose glucosée à l'extrait de levure appelée par les Anglo-Saxons "Plate Count Agar" est utilisée en bactériologie alimentaire pour le dénombrement des bactéries aérobies dans le lait, les viandes, les produits à base de viande, les autres produits alimentaires, ainsi que pour l'analyse des produits pharmaceutiques, des produits cosmétiques et de leurs matières premières.

Aspect du milieu avant utilisation

Aspect du milieu après utilisation

Mode d’ensemencement

Sélectivité / composition

Caractères recherchés

Résultats

- Faire fondre le milieu (s'il est préparé à l'avance).

- Refroidir et maintenir à 48°C.

- Transférer 1 ml du produit à analyser et de ses dilutions décimales successives dans des boîtes de Pétri stériles.

- Couler 10 à 15 ml de milieu.

- Homogénéiser parfaitement.

- Laisser solidifier sur une surface froide.

- Couler 4 ml de gélose blanche stérile

- Laisser solidifier à nouveau.

- Incuber:

Peu être additionné additionné de lait

La casèinase

On tiendra compte des boîtes de Petri contenant un nombre de colonies compris entre 30 et 300

Les bactéries caséolytiques forment un halo plus clair autour de chaque colonie (protéolyse de la caséine du lait)

- Gelose Esculine agar

L'esculine est un hétéroside (molécule composée d'un ose associée à une structure non osidique). L'hydrolyse de l'esculine, catalysée par une b-glucosidase : l'esculinase, est un des critères usuels utilisé dans l'identification différerentielle au sein de nombreux genres bactériens, notamment les Pseudomonadaceae et les Streptococcaceae.

Aspect du milieu avant utilisation

Aspect du milieu après utilisation

Mode d’ensemencement

Sélectivité / composition

Caractères recherchés

Résultats

Piqûre centrale dans le culot, et incubée à 37°C.

Recherhce de l'esculinase

Milieu présente une forte coloration noire : hydrolyse de l’esculine : esculine +

Le milieu ne présente pas de coloration noire : esculine -

- Milieu Rappaport

Milieu sélectif d'enrichissement pour la recherche des Salmonelles.

Aspect du milieu avant utilisation

Aspect du milieu après utilisation

Mode d’ensemencement

Sélectivité / composition

Ensemencer largement.

Incuber 24 h à t°C optimale.

Vert malachite, MgCl₂ et pH acide => rendent le milieu très sélectif permettant un enrichissement en Salmonella à l'exception de Salmonella typhi et Salmonella paratyphi A-B et C.

- Milieu synthétique avec xylose

Ces milieux permettent l’étude du métabolisme glucidique pour l’identification des différentes espèces de Bacillus.

Aspect du milieu avant utilisation

Aspect du milieu après utilisation

Mode d’ensemencement

Sélectivité / composition

Caractères recherchés

Résultats

Ensemencer la pente par des stries serrées à l’öse et le culot par piqûre centrale au fil droit.

Incuber 1 à 15 jours à la température désirée.

Observer tous les jours pendant une à deux semaines

Il ne contient pas de peptone cela permet d’évitter une possible alcalinisation du milieu par dégradation des peptones.

Le métabolisme des glucides qui se fait par la voie oxydative.et fermentative

L’attaque d’un glucide se traduit par un virage du BCP du violet au jaune.

Soit tout le tube ou surtout le culot : espèce fermentative.

Soit de la pente seulement : espèce oxydative.

- Milieu Hypersalée

Ce sont des milieux où les conditions de vie sont très difficiles par modification de pH, de pression osmotique ou par l’addition d’un agent inhibiteur.

Ces milieux sont utilisés dans la macro galerie d’identification des Streptococcus du groupe D.

Aspect du milieu avant utilisation

Aspect du milieu après utilisation

Mode d’ensemencement

Sélectivité / composition

Caractères recherchés

Résultats

Quelques gouttes de suspension

Incubation : 24 à 48 h à 37°C.

Culture en milieu hypersalé

- tube clair : stérile négatif.

- tube trouble : positif.

- Milieu Hyperbilié

Ce sont des milieux où les conditions de vie sont très difficiles par modification de pH, de pression osmotique ou par l’addition d’un agent inhibiteur.

Ces milieux sont utilisés dans la macro galerie d’identification des Streptococcus du groupe D.

Aspect du milieu avant utilisation

Aspect du milieu après utilisation

Mode d’ensemencement

Sélectivité / composition

Caractères recherchés

Résultats

Quelques gouttes de suspension

Incubation : 24 à 48 h à 37°C.

Culture en milieu hyperbilié

- tube clair : stérile négatif.

- tube trouble : positif.

- EPO plus saccharose

Les bactéries peu exigeantes et aérobies facultatives peuvent utiliser le glucide du milieu par fermentation. Cela se traduit par une grande quantité d’acide produit dans le milieu. La fermentation peut s’accompagner de gaz qui s’accumule dans la cloche.

Aspect du milieu avant utilisation

Aspect du milieu après utilisation

Mode d’ensemencement

Sélectivité / composition

Caractères recherchés

Résultats

Chasser tout le gaz de la cloche en retournant vivement le tube plusieurs fois.

Ensemencer largement.

Incuber à t°C optimale 24 h.

Utilisation du glucide du milieu par fermentation

Milieu jaune sans gaz : glucide + sans gaz

Milieu jaune avec gaz : glucide + avec gaz

Milieu rouge : glucide –

Attention aux résultats faussement positif et négatisfs. voir plus d’information.

- Bouillon lactosé au BCP

Aspect du milieu avant utilisation	Aspect du milieu après utilisation	Mode d’ensemencement	Sélectivité / composition	Caractères recherchés	Résultats

- Bouillon BLBVB

Milieu de dénombrement des coliformes en microbiologie alimentaire (analyse des eaux et des aliments).

Aspect du milieu avant utilisation

Aspect du milieu après utilisation

Mode d’ensemencement

Sélectivité / composition

Caractères recherchés

Résultats

la bile

le vert brillant

sont inhibiteurs des bactéries Gram +

le lactose dont la fermentation est révélée par la présence de gaz

Trouble du milieu et gaz sous la cloche alors fermentation lactose alors coliforme.

- Gélose Lowenstein-Jensen

C’est un milieu d’enrichissement, sélectif qui permet le développement des mycobactéries

Aspect du milieu avant utilisation

Aspect du milieu après utilisation

Mode d’ensemencement

Sélectivité / composition

Résultats

Un inhibiteur le vert malachite.

Dans des conditions optimales de croissance les mycobactéries se multiplient lentement, et l'on obtient des colonies après au minimum 7 jours, et jusqu'à 8 semaines pour Mycobacterium tuberculosis