La colonne de Winogradsky

LA COLONNE DE WINOGRADSKY

Illustration de la photosynthèse microbienne et du cycle du soufre

Introduction

L’étude des microorganismes phototrophes ainsi que celle des autres germes impliqués dans le cycle du soufre n’est pas toujours facile à illustrer, bien que présente dans de nombreux programmes d’enseignement.

L’observation directe à partir de prélèvements provenant de l’environnement est possible, mais elle pose un certain nombre de problèmes :

- Où effectuer ces prélèvements ?

- A quel moment (à quelle saison) ?

- Comment identifier les microorganismes observés ?

La réalisation avec des élèves d’une colonne de Winogradsky est une illustration spectaculaire.

Elle est de mise en œuvre simple, et peut être un bon support pédagogique, aussi bien avec des élèves de seconde que de BTS, son exploitation pouvant aller du simple aspect visuel à l’identification des microorganismes et à la caractérisation de leurs interactions métaboliques.

Observation directe

De nombreux microorganismes peuvent être observés à partir de prélèvements "frais" effectués dans l’environnement.

Des représentants des protozoaires, algues, cyanobactéries, mycètes et bactéries se rencontrent fréquemment.

Pour les bactéries, il est intéressant de pouvoir observer des phototrophes, des formes filamenteuses et autres spirilles, qui ne sont pas très fréquents au laboratoire de microbiologie.

Thiothrix forme des masses blanchâtres filamenteuses dans les cours d’eau peu rapides fortement pollués en sulfates.

Beggiatoa est souvent associée aux racines immergées des saules, parfois en présence de l’algue verte filamenteuse Spirogyra.

Achromatium, ainsi que des phototrophes sulfureuses pourpres comme Thiopedia peuvent être observés à la surface de sédiments noirs.

Les phototrophes sulfureuses pourpres peuvent se développer en masse localement, dans des eaux sulfureuses, ainsi qu’au contact du ciment.

Enrichissement en colonne de Winogradsky :

Pour l'observation des bactéries phototrophes, outre l'observation directe qui demande une bonne connaissance des espèces rencontrées, une technique d'enrichissement utilisée depuis longtemps est la réalisation d'une colonne de Winogradsky.

Il s'agit de mélanger

· des sédiments noirs (vase de bord d’étang)

· de la matière organique (papier, fécule de pomme de terre, œufs, vitamine B₁₂, ...)

· ajouter du plâtre (sulfate de calcium) ou du thiosulfate comme réserve de soufre

· supplémenter en carbonate de calcium afin de favoriser la photosynthèse

· remplir au 1/2 ou aux 2/3 une éprouvette de 500 mL haute, et compléter à ras bord avec de l'eau provenant du même milieu.

· Couvrir avec un bouchon ou un parafilm de façon non hermétique, afin de limiter l’évaporation de l’eau sans empêcher une légère oxygénation du milieu.

· Ce montage est disposé près d'une fenêtre et éclairé en permanence toujours du même côté avec au moins une ampoule de 60 W.

Schéma d'une colonne "idéale"

Il est pratiquement impossible d'obtenir en même temps tous les groupes de microorganismes représentés sur ce schéma. Par contre, on peut observer leur succession au cours du temps.

Au bout de quelques jours la matière organique noircit par production d'H₂S (essentiellement par réduction des sulfates et sulfites par Clostridium et Desulfovibrio). Pratiquement tout l'oxygène du milieu est consommé par les germes aérobies et il se forme des gradients contraires d'oxygène dissout et de sulfure d'hydrogène.

Généralement, Rhodospirillum rubrum, bactérie pourpre non sulfureuse, se développe en premier dans la colonne à la surface des sédiments : dès que l'anaérobiose est suffisante et avant que la production d'H₂S soit importante.

Les bactéries sulfureuses vertes se développent ensuite juste en dessous pour former un second anneau, de couleur verte. Elles sont supplantées par les bactéries phototrophes pourpres sulfureuses peu après.

RESULTATS D'EXPERIENCES

Résultats obtenus au printemps 2002 – BTS Biotechnologies – La Martinière-Duchère

Chlorobium

Rhodospirillum

Chromatiaceae

Chromatiaceae

Sédiments de la rize, papier filtre, plâtre (enduit de rebouchage "alabastine"), vit. B₁₂

Résultats obtenus en 2003/2004 – BTS Biochimiste – Ambérieu

26 septembre 2003 : réalisation d'une colonne. Dans une éprouvette de 1 litre, on introduit des sédiments très noirs prélevés en sous-bois dans un cours d'eau peu rapide. On ajoute du papier filtre, environ 15 g de plâtre de Paris et 15 g de carbonate de calcium et 15 g d'amidon, vitamine B12. On introduit environ 500 mL dans la colonne et complète avec de l'eau du même cours d'eau, on recouvre avec un couvercle de boîte de Pétri. La colonne est disposée près d'une fenêtre avec une source lumineuse additionnelle de 60 W.

Au bout de quelques jours les sédiments deviennent entièrement noirs avec présence de gaz. Une croûte de surface blanchâtre se forme. Une odeur d'H₂S apparaît…

5 novembre 2003 : on observe un voile rouge à la surface des sédiments. Une partie est prélevée et observée au x 40 : on observe des spirilles très mobiles de grande taille (environ 10 µm).

7 novembre 2003 : On trace le spectre des cellules entières en suspension dans l'eau entre 340 et 1100 nm : les pics sont à 374, 480, 514, 546, 587, 801 et 883 nm. En comparant le spectre obtenu à des spectres de référence, on identifie la bactérie comme étant Rhodospirillum rubrum (bactérie phototrophe pourpre non sulfureuse).

Exemple de spectre obtenu pour la bande rouge de la colonne le 3 mars 2004 : Il s'agit bien de Rhodospirillum rubrum.

10 décembre 2003 : une bande verte est apparue sous la bande rouge qui s'est un peu estompée. On observe au x 40 de grands bacilles pas très réguliers de couleur verte. Le spectre des cellules entières en suspension dans l'eau nous permet d'identifier Chlorobium limicola (bactérie phototrophe sulfureuse verte) :

On peut également trouver dans ce type de colonne : des algues, des cyanobactéries et divers ciliés.

En particulier, si on supplémente les sédiments avec de la fécule de pommes de terre, on peut observer la présence de nombreux ciliés de l’espèce Paramecium bursaria, paramécies hébergeant dans leur cytoplasme des zoochlorelles.

Les bactéries phototrophes :

Procaryotes phototrophes
Photosynthèse anaérobie				Photosynthèse aérobie
Bactéries pourpres		Bactéries vertes		Cyanobactéries
Non sulfureuses	Sulfureuses	Non sulfureuses	Sulfureuses	Cyanobactéries
Rhodospirillum	Thiospirillum	Chloroflexus	Chlorobium	Anabaena
Rhodopseudomonas	Chromatium		Prosthecochloris	Oscillatoria
Rhodobacter	Thiocapsa		Pelodictyon	Microcystis
Rhodocyclus	Amoebobacter		Chlorochromatium
Rhodomicrobium	Thiopedia		Pelochromatium
Heliobacterium	Ectothiorhodospira

Les bactéries phototrophes sont présentes dans la plupart des milieux liquides. Dans les lacs et les étangs, elles sont trouvées à des profondeurs différentes en fonction de leur comportement vis à vis de l'oxygène, de leurs besoins en H₂S et de leur équipement pigmentaire qui leur permet de capter la lumière à une profondeur plus ou moins grande.

L'observation d'un prélèvement de sédiment noir au bord d'un étang (à 15-20 cm de profond) permet d'observer diverses espèces de bactéries phototrophes dont certaines ont une forme, un mode de groupement ou de déplacement caractéristique.

Formule chimique des bactériochlorophylles

source : The Prokaryotes – Vol I

Bactéries impliquées dans le cycle du soufre

Réduction

Oxydation

Desulfovibrio, Desulfobacterium, Desulfobacter, Desulfococcus, Desulfoarculs, Desulfomonas, Desulfobacillus, Desulfosarcina, Desulfobulbus, Desulfobotulus, Desulfomicrobium, Thermodesulfobacterium, Desulfonema, Desulfotomaculum Archaeoglobus

Chromatium, Rhodobacter, Thiopedia, Chlorobium.

Thiobacillus, Thiothrix, Sulfolobus, Beggiatoa, Achromatium

Le soufre, élément indispensable à la vie, n’est présent chez les êtres vivants qu’à raison de 1 à 2 % de leur masse. Il l’est sous forme d’acides aminés soufrés (cystéine, méthionine) ainsi que dans les centres fer-soufre des protéines.

Dans la nature, le soufre est le plus souvent sous forme de sulfate, dans la mer et la roche, ou de sulfure de sels métalliques (pyrite par exemple). Il peut également être présent sous forme élémentaire, c’est le soufre que l’on rencontre près des volcans.

Le cycle du soufre fait intervenir dans la nature un certain nombre de microorganismes : les sulfatoréducteurs anaérobies tels que Desulfovibrio ou Clostridium ; Les bactéries phototrophes (Chromatium, Thiopedia...), des bactéries aérobies telles que Thiobacillus ou Achromatium, des archaebactéries comme les bactéries méthanogènes.

La réduction des sulfates

La réduction des sulfates et autres formes oxydées naturelles du soufre peut s’effectuer de deux manières :

· La réduction assimilatrice qui produit des ions sulfure, nécessaires aux synthèses cellulaires.

· La réduction dissimilatrice, dans laquelle le composé soufré oxydé sert uniquement d’accepteur final d’électron dans la production d’ATP en anaérobiose ("respiration sulfates").

Les bactéries sulfatoréductrices se trouvent essentiellement dans les sédiments noirs et la vase où la matière organique est décomposée en atmosphère anaérobie (jusqu'à 10⁷ sulfatoréducteurs/mL de sédiments). Le sulfure d'hydrogène dégagé correspond au produit terminal de la respiration des sulfates (dissimilatrice).

Desulfovibrio produit du soufre et du sulfure d'hydrogène par décomposition du sulfate contenu dans l'eau de mer. Cette bactérie intervient également indirectement dans la corrosion du fer en libérant des protons à partir de l'hydrogène moléculaire. Les ions ferriques formés précipitent les sulfures pour former du sulfure de fer et donner leur couleur noire aux sédiments.

Pour enrichir les bactéries sulfatoréductrices, on peut ensemencer un milieu nutritif contenant du lactate et du sulfate et ajouter un grand clou qui procure au milieu un potentiel redox suffisamment bas par polarisation cathodique.Le soufre élémentaire ainsi que d'autres substrats comme le thiosulfate, le sulfite ou le DMSO (diméthyl sulfoxyde) peuvent être réduits par des bactéries aérobies facultatives telles que Campylobacter, Proteus, Pseudomonas ou Salmonella.

La réduction du soufre :

Le soufre (S°) peut encore jouer le rôle d’accepteur d’électrons : Le soufre élémentaire doit être réduit en sulfure par Desulfuromonas acetoxidans qui ne peux pas réduire le sulfate en sulfite. Cette réaction est couplée avec l'oxydation de substrats tels que l'acétate ou l'éthanol.

Oxydation du soufre :

Le soufre élémentaire et/ou les sulfures sont oxydés en sulfate.

Soit en conditions anaérobies par les bactéries phototrophes telles que Chromatium, Rhodobacter, ou Chlorobium.
Soit en conditions aérobies par

- Thiobacillus thiooxydans dans les milieux acides.

- Thiothrix, Sulfolobus et Beggiatoa dans les milieux neutres.

Description des bactéries rencontrées

Chromatium

bacille Gram négatif incurvé de grande taille, large et arrondi, contenant des inclusions de soufre. Il se déplace grâce à deux flagelles polaires.

phototrophe anaérobie

sulfureuse pourpre

Thiopedia rosea

Les cellules rondes de Thiopedia rosea forment des colonies rouges en "carré".

phototrophe anaérobie

sulfureuse pourpre

Rhodospirillum rubrum

Spirille Gram négatif, très mobile par flagellation polaire

phototrophe anaérobie

pourpre non sulfureuse

Thiocystis

phototrophe anaérobie

sulfureuse pourpre

Thiospirillum

Forme spirillaire, inclusions de soufre

phototrophe anaérobie

sulfureuse pourpre

Chlorobium, voir

http://www.egbeck.de/skripten/12/bs12-24b.htm

phototrophe anaérobie

sulfureuse verte

Chloroflexus

phototrophe anaérobie

sulfureuse verte

Anabaena

Cyanobactérie

phototrophe aérobie

non sulfureuse

Oscillatoria

Cyanobactérie

phototrophe aérobie

non sulfureuse

Microcystis

Cyanobactérie

phototrophe aérobie

non sulfureuse

Thiobacillus

Bacilles Gram négatif

aérobie chimiolithotrophe

Achromatium oxaliferum

x 400 entre deux Euglènes

Achromatium oxaliferum est une bactérie sulfureuse ronde, non phototrophe. Elle contient des inclusions de soufre et de carbonate de calcium. Les corps microbiens sont de grande taille (jusqu'à 100 µm). Ces bactéries se rencontrent à la surface des sédiments.

Desulfovibrio, voir

http://www.rohmhaas.com/rhcis/markets_and_products/applications.html

anaérobie

sulfatoréducteur

Clostridium

Bacille à gram positif, sporulé.

anaérobie

sulfitoréducteur

Beggiatoa alba

x 400

C'est une bactérie filamenteuse Gram - incolore contenant de nombreuses inclusions de soufre dans son cytoplasme. Elle s'observe facilement dans des prélèvements de vase, à 20 cm sous la surface de l'eau. Elle peut être trouvée fixée sur des algues vertes filamenteuses et associée à Thiopedia rosea. Elle se déplace par glissement, comme Oscillatoria dont elle est phylogénétiquement proche.

Thiodictyon elegans

x 1000

Composition des milieux de culture

Mileux de culture pour Chromatium spp

Solution I : Oligo-éléments

NH4Cl 0.1 g Eau distillée 1 L

KH2PO4 0.1 g NaEDTA 5,2 g

MgCl2 0.05 g FeCl2, 4H2O 1,5 g

Agar 20 g ZnCl2 70 mg

Eau 780 mL MnCl2, 4H2O 100 mg

H3BO3 6 mg

Solution II : CoCl2, 6H2O 190 mg

CuCl2, 2H2O 17 mg

NaHCO3 2 g NiCl2, 6H2O 25 mg

Eau 100 mL Na2MoO4, 2H2O 188 mg

VoSO4, 2H2O 30 mg

Solution III : Na2WO4, 2H2O 2 mg

Na2S, 9H2O 1 g

Eau 100 mL

Stériliser séparément 15 minutes à 120°C, refroidir à 50 °C et mélanger II et III dans I. Répartir en tubes de 16 mm

Il est également conseillé d'ajouter de la vitamine B12 à raison de 20 µg/L et 1 mL/L de solution d'oligo-éléments.

Milieux de culture pour Rhodopseudomonas et Rhodospirillum

NH4Cl 0.5 g

MgSO4, 7H2O 0.4 g

CaCl2, 2H2O 0.05 g

NaCl 0.4 g

Sodium-hydrogène Malate 1.5 g

Extrait de levure 0.1 g

Eau qsp 1000 mL

Amener au pH choisi avec le tampon phosphate suivant :

Na2HPO4, 12 H2O 0.1 M (35.85 g/l) , NaH2PO4, 2H2O 0.1 M (15.6 g/l)

pH 5.0-6.0 favorise Rhodopseudomonas acidophila (pH max=5.5)et Rhodomicrobium vannielii

pH 7.0 favorise Rhodospirillum rubrum et Rhodopseudomonas palustris.

Milieu pour bactéries sulfureuses

NH4Cl 0,1 %, KH2PO4 0,1 %, MgCl2 0,05 %, NaHCO3 0,2 %, Na2S - 9H2O 0,1 %, NaCl 0,1 %

Milieu pour bactéries non sulfureuses

NaHCO3 0,5 %, NaCl 0,2 %, (NH4)2SO4 0,1 %, K2HPO4 0,05 %, MgSO4 0,01 %, extrait de levures 0,2 %, Na2S - 9H2O 0,01 %.

Pour ces deux derniers milieux, autoclaver en bouteilles de 120 mL (ne laisser qu'un peu de lace pour l'inoculum). De l'Agar peut être ajouté pour solidifier le milieu à raison de 15 g/L afin de pouvoir couler des boîtes.

Ensemencement : Ajouter 5 mL de sédiment noir provenant d'un milieu aquatique et remplir au maximum le flacon avec du milieu de culture. Boucher hermétiquement.

Milieu de culture pour Thiobacillus thiooxydans

NH4Cl 0,1 g

KH2PO4 3,0 g

MgCl2, 6H2O 0,1 g

CaCl2, 2H2O 0,14 g

Soufre en poudre 10,0 g

Eau distillée qsp 1000 mL

Dissoudre tous les ingrédients sauf le soufre, ajuster pH 4,2 et autoclaver. Stériliser le soufre à part dans un flacon. Avant l'emploi, déposer le soufre à la surface du milieu autoclavé. Ajouter éventuellement 0,01 % d'extrait de levure stérilisé à part.

Milieu de culture pour Beggiatoa

Oligo-éléments :

CaSO4 (solution saturée) 20 mL EDTA 0,2 g

NH4Cl 0,45 mg FeSO4, 7H2O 0,7 g

K2HPO4 0,1 mg ZnSO4, 7H2O 0,01 g

MgSO4, 7H2O 0,2 mg MnSO4, 4H2O 2 mg

Solution d'oligo-éléments 5 mL CuSO4, 5H2O 5 µg

Na-acétate 0,5 g H3BO3 10 mg

Bouillon nutritif (Difco) 0,5 g Co(NO3)2 1 mg

Agar 10 g Na2MoO4, 2H2O 1 mg

Catalase filtrée 0,22 µm 15 000 - 35 000 unités Eau qsp 1000 mL

Eau distillée qsp 1000 mL

Ajuster pH 7,4 avant d'autoclaver. La catalase est ajoutée au moment de l'emploi.

Milieu pour Desulfovibrio

solution 1 :

K2HPO4 0,5 g solution 2 :

NH4Cl 1,0 g FeSO4, 7H2O 0,5 g

Na2SO4 1,0 g Eau distillée 10 mL

CaCl2, 2H2O 0,1 g

MgSO4, 7H2O 2,0 g

DL-Na lactate 2,0 g

Extrait de levure 1,0 g

Resazurine 1,0 mg

Eau distillée 980 mL

solution 3 :

Thioglycolate de sodium 0,1 g

Acide ascorbique 0,1 g

Eau distillée 10 mL

Faire bouillir la solution 1 puis refroidir sous azote. Ajouter les solutions 2 et 3, ajuster pH 7,8 NaOH et distribuer en tubes d'anaérobiose. Bien répartir le précipité gris. Autoclaver.

Le thioglycolate et l'ascorbate sont des agents réducteurs.

Le développement de Desulfovibrio est visible par l'apparition d'un précipité noir de sulfure de fer après 15 jours à 30 °C.

Bibliographie