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Préparation de mitochondries de cellules cardiaques

TP proposé par G.Grousset, réalisé au lycée La Martinière Duchère,
à partir d’un TP proposé aux journées nationales ExAO et nouvelles technologies de Marseille

Matériel nécessaire


    - un cœur de mouton, de porc ou de bœuf,
    - une planche, un couteau à découper,
    - un broyeur ou mini-moulinette,
    - une balance électronique,
    - une centrifugeuse, tubes à centrifuger,
    - un ou deux cristallisoirs,
    - tubes à hémolyse dans portoir,
    - un bécher, un erlenmeyer, un agitateur (baguette de verre),
    - deux pipettes de 10 mL avec poire,
    - réserve de glace,
    - 400 mL d’une solution tampon, pH=7,2,
    - un milieu d’extraction des mitochondries (cf préparation ci-dessous),
    - une solution de succinate de sodium à pH=7,2,
    - une solution de glucose à 20 g/L (diluée dans la solution tampon)
    - feuilles de Laurier cerise, mortier, pilon,
    - système d’ExAO avec mesure d’oxymétrie, prêt à l’emploi,
    - 3 seringues ExAO avec aiguille coudée et cathéter.

 

Préparation des solutions

  • milieu d’extraction

      - solution de phosphate monopotassique à 9,08 g de KH2PO4 par litre,
      - solution de phosphate disodique à 9,47 g de Na2HPO4 par litre,
      - mélanger 322 mL de la solution de phosphate disodique et 78 mL de la solution de phosphate monopotassique pour obtenir 400 mL de solution tampon à pH= 7,2,
      - ajouter aux 400 mL, 800 mg de Sérum Albumine bovine (S.A.B.),
      - ajouter enfin 45 g de mannitol et éventuellement 0,02 g de KCl et 0,02 g de MgCl2.
       
  • solution de succinate de sodium (acide organique du cycle respiratoire)

      - faire 10 mL à une concentration de 400 mmoles (acide succinique C4H6O4, PM=118 g),
      - amener ensuite, au pHmètre, avec de la soude à 30%, l’acide succinique à pH=7,2. NB : une utilisation directe d’acide succinique ne permettra pas de réaliser la manipulation,
      - si l’on dispose de succinate de sodium, faire simplement une solution de succinate à 20 g/L (contrôler le pH et l’amener éventuellement à 7,2).
       
  • solution d’acide cyanhydrique (inhibiteur de respiration)

      - découper 2 ou 3 feuilles de Laurier Cerise dans un mortier et broyer en ajoutant 20 mL environ de solution tampon.
      - la solution doit avoir une légère odeur d’amande amère.

 

Protocole d’extraction : suivre les schémas ci-dessous


    - si l’on ne dispose pas de centrifugeuse, on peut filtrer au lieu de centrifuger (opération 9)
    - filtrer alors sur coton et recueillir le filtrat.
     

    - oxygéner le surnageant obtenu (ou le filtrat) dans un bécher sur glace à l’aide d’un agitateur magnétique pendant 5 min au moins avant l’utilisation afin de saturer en O2 les transporteurs et favoriser l’épuisement en substrats divers.

 

Eléments pour l’élaboration d’un protocole de mesure


    - prévoir une mesure d’environ 8 min,
    - utiliser 6 mL de suspension mitochondriale dans l’enceinte de mesure,
    - la quantité de substances à introduire à la seringue est de 0,1 mL /injection.
    - On rappelle que :
    • le glucose est un métabolite respiratoire cellulaire,
    • l’acide succinique est un métabolite respiratoire,
    • l’acide cyanhydrique est un poison de la respiration, c’est-à-dire qu’il bloque l’activité respiratoire.

 

Pistes d’utilisation


    - distinction respirations cellulaire et mitochondriale (1 S),
    - nécessité de dégradation du glucose dans la cellule (1 S),
    - utilisation finale du dioxygène dans les mécanismes respiratoires (1 S).

 

Voir des exemples d’enregistrements ExAO :
-> Action glucose, succinate ;
-> Blocage par l’antimycine, par des extraits de laurier-cerise.