Techniques de laboratoire

La microscopie confocale permet d'étudier la localisation de différentes protéines dans les cellules. Des cellules PC12 (lignée tumorale dérivée de la crête neurale, chez le Rat) ont été transfectées pour exprimer la cavéoline 1 (protéine permettant de former des vésicules sur les membranes) et TrkA (récepteur du NGF=Nerve Growth Factor). TrkA a la particularité d'être fusionné à la GFP (Green Fluorescent Protein), ce qui permet de le localiser par fluorescence verte. La cavéoline 1 est détectée par un anticorps de lapin suivi d'un anticorps secondaire anti-lapin couplé à un fluorochrome rouge. Elle apparaît donc en rouge. Le récepteur à la transferrine est détecté par un anticorps de souris suivi d'un anticorps secondaire anti-souris couplé à un fluorochrome bleu. Il apparaît donc en bleu. Légendes: (A) Le marquage du compartiment endosomal par le récepteur à la transferrine (Tnf-R) apparaît en bleu. (B) Marquage de la cavéoline 1 en rouge. (C) Superposition des marquages Tnf-R et cavéoline 1 ; les zones de colocalisation apparaissent en rose. (D) Localisation subcellulaire de TrkA-GFP révélée par la fluorescence verte de la GFP. (E) Superposition des marquages TrkA-EGFP et cavéoline 1 ; les zones de colocalisation apparaissent en jaune. (F) Superposition des marquages Tnf-R, TrkA-GFP et cavéoline 1 ; les zones de colocalisation apparaissent en blanc. Barre = 5 micron.
L'observation par microscopie confocale montre que la cavéoline 1 et TrkA-GFP sont très largement co-localisés à la fois à la surface cellulaire (pointe de flèche) et à l'intérieur de la cellule (flèche). Le compartiment intracellulaire où se co-localisent la cavéoline 1 et TrkA-GFP est également marqué par un anticorps dirigé contre le récepteur à la transferrine. Le marquage périphérique correspond à des sites particuliers de la membrane plasmique, des filopodes enrichis en actine sous-membranaire. Le marquage intracellulaire correspond aux endosomes précoces et de recyclage, enrichis en récepteur à la transferrine. Des mouvements vésiculaires déplacent TrkA-EGFP entre ces deux localisations cellulaires. On peut noter la présence de 2 cellules (en haut à droite) sans marquage Cavéoline 1. Ces deux cellules n'ont pas été transfectées par le vecteur d'expression de la protéine (la transfection d'une population de cellules n'est jamais efficace à 100%).

La microscopie confocale permet d'étudier la localisation de différentes protéines dans les cellules.  Des cellules PC12 (lignée tumorale dérivée de la crête neurale, chez le Rat) ont été transfectées pour exprimer la cavéoline 1 (protéine permettant de former des vésicules sur les membranes) et TrkA (récepteur du NGF=Nerve Growth Factor).  TrkA a la particularité d'être fusionné à la GFP (Green Fluorescent Protein), ce qui permet de le localiser par fluorescence verte.  La cavéoline 1 est détectée par un anticorps de lapin suivi d'un anticorps secondaire anti-lapin couplé à un fluorochrome rouge. Elle apparaît donc en rouge.  Le récepteur à la transferrine est détecté par un anticorps de souris suivi d'un anticorps secondaire anti-souris couplé à un fluorochrome bleu. Il apparaît donc en bleu.  Légendes: (A) Le marquage du compartiment endosomal par le récepteur à la transferrine (Tnf-R) apparaît en bleu. (B) Marquage de la cavéoline 1 en rouge. (C) Superposition des marquages Tnf-R et cavéoline 1 ; les zones de colocalisation apparaissent en rose. (D) Localisation subcellulaire de TrkA-GFP révélée par la fluorescence verte de la GFP. (E) Superposition des marquages TrkA-EGFP et cavéoline 1 ; les zones de colocalisation apparaissent en jaune. (F) Superposition des marquages Tnf-R, TrkA-GFP et cavéoline 1 ; les zones de colocalisation apparaissent en blanc. Barre = 5 micron.    <BR>  L'observation par microscopie confocale montre que la cavéoline 1 et TrkA-GFP sont très largement co-localisés à la fois à la surface cellulaire (pointe de flèche) et à l'intérieur de la cellule (flèche). Le compartiment intracellulaire où se co-localisent la cavéoline 1 et TrkA-GFP est également marqué par un anticorps dirigé contre le récepteur à la transferrine.  Le marquage périphérique correspond à des sites particuliers de la membrane plasmique, des filopodes enrichis en actine sous-membranaire. Le marquage intracellulaire correspond aux endosomes précoces et de recyclage, enrichis en récepteur à la transferrine. Des mouvements vésiculaires déplacent TrkA-EGFP entre ces deux localisations cellulaires.  On peut noter la présence de 2 cellules (en haut à droite) sans marquage Cavéoline 1. Ces deux cellules n'ont pas été transfectées par le vecteur d'expression de la protéine (la transfection d'une population de cellules n'est jamais efficace à 100%).

- 2001 - Vincent Guili
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